神経細胞の新生の現場をおさえる（３）

グリアがニューロンになる話

石龍徳

ミクロスコピア 25(4): 35-40 (2008)より許可を得て転載

 大人の脳でもニューロンが生まれているという発見は、100年間信じられてきた脳科学の常識が破られるような大発見だった。このような、今まで信じられていた常識を破る大発見は、そうたびたび起こらない。しかし、この分野ではもう一度大きな発見があった。そのカギとなるのは、ニューロンを作り出すおおもとの細胞、神経幹細胞だ。

神経幹細胞とは

研究はいつも順調とは限らない。ある時は、幸運にも重要なことを発見出来ても、別の時には「あのときに気が付いていれば大発見が出来たかも？」という苦い経験をする。私にも、そのような経験があり、そのことを思い出すと、「なんて私は愚かだったのか」とため息が出る。私の場合、その残念な話とは？

　今まで2回に渡って、大人の脳の中でも、記憶や学習と関係が深い海馬と呼ばれる部位では、神経細胞が新しく生まれて、新しい神経回路を作っているという話をした。この現象は1960年代にAltmanが発見していたが、認められず、ようやく1990年代後半になって、多くの研究者が認めるような定説となった1)。しかし、まだなぞの多い現象であった。たとえば、ニューロンを作り出すおおもとの細胞がどのような細胞であるのかが分からなかったのだ。体の組織の中で、ある細胞が新しく生まれるためには、そのもとになる細胞である幹細胞が必要だ。たとえば、皮膚（表皮）の細胞は常に新しく置き換わっているが、この場合は、表皮の一番下に表皮の細胞を作り出す幹細胞がある。ニューロンが新しく生まれている場所であれば、そこには神経幹細胞があるはずだ。神経幹細胞は、自分自身を増やすことができるとともに、ニューロンなどの神経組織の細胞を生み出すことができる細胞である。その当時、脳が発達する胎児期に現れる神経幹細胞については、ある程度その性質が知られていたが、大人の脳でニューロンを作っている神経幹細胞については、まったく見当がつかなかった。

　幹細胞を見るためにはどのようにしたら良いのか？幹細胞は増殖するので、増殖する細胞を染色すれば、幹細胞が見えるのではないかと考える人が多いかも知れない。実はそれだけでは幹細胞を見つけ出すことはできない。どうしてかというと、増殖している細胞には、おおもとの神経幹細胞と、次の段階の神経前駆細胞があるからだ。神経幹細胞からニューロンが作られるときには、いくつかの段階を経ると考えられており、その途中にある前駆細胞も、増殖する性質がある。つまり、増殖した細胞を染色しただけでは、どの段階の細胞であるかがはっきりしない。しかも、やっかいなことに、たいていの組織の幹細胞は増殖が遅く、次の段階の前駆細胞は増殖が速い。そうすると、増殖している細胞の大半は、前駆細胞、ごく一部が幹細胞ということになる。しかも、1990年代後半、この神経幹細胞と神経前駆細胞を区別する方法はまだ知られていなかった。

ニューロンが減るとグリアも減る？

その当時、私自身は、神経幹細胞の研究をしようとは思っていなかった。私の場合、大人の海馬で新生しているニューロンの全体像を、未熟ニューロンのマーカーであるポリシアル酸（PSA）を目印として、見る方法を開発できたので、それを利用して、新しく生まれたニューロンが、大人の脳組織の中で神経回路を作る様子を観察しようと考えていた2) 1)。具体的には、発達中のPSA陽性ニューロンの入力側にあたる樹状突起と、出力側の軸索の発達を見ることした。しかし、後で述べるように、この実験の結果の中には、神経幹細胞に関する重要なヒントが隠されていたのだ。

　樹状突起の発達を見ていて、少しやっかいだったのは、新生ニューロンの形と似た別の細胞があることだった。新生ニューロンは、顆粒細胞の外側に向かって樹状突起を伸ばすが、その細胞も同じように外側に突起を伸ばしていた。だだし、新生ニューロンは、未熟ニューロンに特徴的なPSA分子を発現するが、もう一方の細胞は、星状グリア細胞に特徴的な、グリア線維性酸性タンパク(GFAP)を発現していた（図1）。星状グリア細胞とは、脳組織をニューロンと共に作っている細胞で、ニューロンが電気的な情報を伝えるのに対して、星状グリア細胞は、自らは情報のやりとりには無関係だが、ニューロンの活動を助ける役割をしている。つまり、二つの細胞はまったく別物である。

脳の中のほとんどの星状グリア細胞は、その名の通り星形をしているのに、大人の海馬で、ニューロンが新しく生まれている顆粒細胞層には、星状グリア細胞に特徴的なGFAPを発現するが、星状グリア細胞とは言い難い、外側に伸びる長い突起を持った、不思議な形のグリア細胞がある。紛らわしいので、新生ニューロンをポリシアル酸分子に対する抗体で染色するときには、時々隣の切片をGFAPに対する抗体で染色したり、同じ切片のGFAP分子を別々の色で染色したりしていた。ある時、高齢のラットをそのようにして染色してみた。なぜなら、それまでの研究で、新しく生まれるニューロンの数が、年齢と共に少なくなることを明らかにしていたので、この形の似たGFAP陽性細胞についてもどうなるか調べてみたくなったのだ。実験する前の予想では、GFAP陽性細胞の方は、形は似ているものの、ニューロンの新生とは関係がないので、まったく変化しないと考えた。ところが驚いたことに、GFAP陽性の長い突起をもったグリア細胞も、年齢と共に数が少なくなっていた（図2）。いったいどうなっているのだ？ 

まったく分からない現象なので、この通常の星形とは違う細長い突起を持ったGFAP陽性細胞のことを文献で調べてみた。すると、2-3の論文が見つかった。ある論文では、この不思議なグリア細胞のことを、残存型の放射状グリアと名付けていた。このグリア細胞は、半円を描く顆粒細胞層の外側に向かって、長い突起を突き出しているので、突起が放射状に並ぶ。それが、放射状という言葉を使った理由である。また、一般には、放射状グリア細胞という名は、大脳新皮質の発生の時に現れる細胞として、よく知られている。大脳新皮質の発生の時に現れる放射状グリア細胞は、神経細胞が移動するときの足場になると考えられていて、発達がほぼ終了する生後初期には消失してしまうことが知られていた（この考えは、連載第二回で登場したRakicが提唱した有名な説だ）。つまり放射状グリア細胞は、大脳皮質の発達過程で一時的に現れる細胞である。一方、海馬の発生では、顆粒細胞層が形成される時に、やはり同じように放射状グリア細胞が現れるが、こちらの方は大人になっても残る。それで、この細胞を残存型の放射状グリア細胞と名付けたのである。

　自分の実験結果は、残存型の放射状グリア細胞と、新しく生まれるニューロンが、年齢と共に減少することを示していた。つまり、時間的に両者には関係があることになる。その意味は分からなかったが、取りあえず、空間的な関係も調べてみた。すると、新生ニューロンと放射状グリア細胞の突起が頻繁に接触していたのだ。このことから、新生ニューロンと放射状グリアには、時間的空間的な関連があるという記載的な論文を1999年に書いた3)。その機能につては、はっきりした結論が出せなかったが、樹状突起の発達に関係があるのではないかとの推論を述べた。しかし、この結果にはもっと重大な意味が含まれていたのだ。それが分かるまでには後2年の歳月を要する。

日本人の研究仲間現れる

海馬の放射状グリア細胞は、いわばマイナーな話題で、その当時ほとんど研究されていなかった。しかし、ある時神経科学学会のポスターを見ていたら、ふっと放射状グリア細胞とそっくりの写真を見つけた。そのポスターは、東京大学大学院新領域創成科学の久恒辰博先生の研究室の大学院生福田諭君のポスターだった。彼は、ネスチンという分子を発現する細胞が、緑の蛍光タンパクによって光るように工夫された遺伝子改変マウスを使って、大人の海馬で生まれるニューロンの性質を電気生理学的な手法を用いてに調べていた。この貴重なマウスは東京大学大学院医学研究科分子生理学教室の山口正洋先生が世界に先駆けて開発されたものだ4)。ネスチンは体の様々な組織に存在する幹細胞や前駆細胞に発現している分子である。しかし、良い抗体が無いために、ネスチン抗体を使った免疫組織化学では、海馬の神経幹細胞をうまく検出することはできなかった。そのようなわけで、ネスチン発現細胞を緑色蛍光タンパクで光らせるような遺伝子改変マウスは、大人の脳で新しく生まれるニューロンを研究する道具としては画期的な動物だ。その後、世界中で大活躍する動物である。福田君は、このマウスの緑に光るネスチン発現細胞を調べていて、その細胞が2種類の性質の細胞に分かれることに気がついた5)。しかし、その実態が何であるのかについては、まだ分からなかった。ポスターの前で立ち止まって話してみると、2種類の細胞のうち、一つは、星状グリア細胞のマーカーであるGFAPを発現する長い突起をもった細胞で、もう一つは、未熟ニューロンのマーカーであるPSAを発現していた。彼は、放射状の形をした細胞であるにもかかわらず、星状グリア細胞に特徴的なGFAPを発現する細胞の正体が分からないと言う。そこで、自分の出した1999年の論文について語りながら、そこには、残存型の放射状グリア細胞と呼ばれるGFAP陽性細胞があるとの話をした。その場では、話はそれ以上進まなかったが、今から考えれば、その時すでにGFAP陽性細胞については、不思議な論文が出ていたのだ。

グリアがニューロンになる？

その不思議な論文を出したグループのボスは、アルバレス-ブイラAlvarez-Buylllaで、彼らはラットの側脳室下帯の神経幹細胞がGFAP陽性であることを1999年に発表していた6)。ここで、側脳室下帯のニューロン新生について少し話しておこう。今まで、大人の脳でもニューロンが生まれる場所として海馬の話をしてきたが、実は大人の脳でニューロンが生まれる場所は2つあり、もう一つの場所は、側脳室下帯と呼ばれる。側脳室とは大脳に空いている穴（脳室）で、この穴の周囲でニューロンが生まれて、前方（鼻側）の嗅球（嗅覚に関係している脳の部分）に向かって移動する（この現象については元東邦大学医学部解剖学教室の岸清先生が先駆的な研究をされている7)）。こちらのニューロン新生についても、90年代になってから、急速に研究が進んだ。その立役者がアルバレス-ブイラである。彼は1980年代に大人のトリの脳でニューロン新生が歌の学習と関係があることを発見した、ノッテボームのラボにいた研究者で（連載第1回に紹介）、初めはトリのニューロン新生を研究していたが、1990年代半ばになって、大人のネズミの側脳室下帯のニューロン新生を研究し始め、立て続けに重要な論文を出版していた。

　アルバレス-ブイラらの論文では、巧妙な手法によって、GFAP陽性細胞からニューロンが生まれてくることを示していたが、あまりにも発想が突飛なので、その論文を支持する研究が現れるまでは、即座に受け入れがたい雰囲気があった。神経科学の研究者なら、GFAP陽性細胞といえば、誰でも星状グリア細胞のことを思い浮かべる。前にも述べたように、星状グリア細胞とニューロンはまったく別の細胞である。したがって、GFAP陽性細胞からニューロンが生まれてくるとはにわかには信じがたい。しかし、おそらくその発想のおおもとはトリの研究にあったにちがいない。驚くことに、1990年に、アルバレス-ブイラらは、トリのニューロン新生では、脳室周囲の放射状グリア細胞からニューロンが生まれるという論文を出版している8)。トリがそうなら、ネズミで同じことがあっても良いと考えたのだろう。

放射状グリア細胞の正体

そうこうしているうちに、2001年に胎児の大脳新皮質と大人の海馬で重要な論文が立て続けに出版された。場所や性質は違うが、どちらも、放射状グリア細胞と呼ばれていたものが、実は神経幹細胞であったことを示す論文である。胎児の大脳皮質の論文では、今まで、ニューロンが移動する時の、単なる足場として考えられていた放射状グリア細胞が、実は神経幹細胞であり、分裂してニューロンになることが証明された。これは神経科学の教科書を書き変えるような発見だ。この研究は、３つのグループからほぼ同時に発表された。２つは日本人のグループで、熊本大学医学部解剖学教室の玉巻伸章、現名古屋大学医学部解剖学教室の宮田卓樹、もう１人はアメリカのコロンビア大学のノクターNoctorである。大人の海馬での研究は、アルバレス-ブイラのグループのセリSeriがやった研究で、1999年の側脳室下帯で使われた実験方法を用いて、顆粒細胞層に存在するGFAP陽性細胞が神経幹細胞であることを示した9)。

　ああ、そうだったのか。私がかつて見ていた新生ニューロンと放射状グリア細胞の時間・空間的な関係は、彼らの発見によって、きれいに説明出できる。年齢に伴って、神経幹細胞は減少し、それに伴って、生まれてくる新生ニューロンも減少するのだ。当たり前の現象だ。考えてみれば、増殖する放射状グリア細胞を見たこともあった（図3）。文献的にも、トリの放射状グリア細胞の研究を考えれば、この謎の関係を解くカギは、すでに用意されていたのだ。トリの論文は1999年の論文を書く時にはもちろん知っていた。しかし、教科書に載っている常識を超えて、発想することは非常に難しい。今から考えれば気がつかない方が不思議だが、当時の状況はそうではない。

映画監督になりたい

しかし、いずれにしても、ひとりぼっちで研究している私に、彼らのような巧妙な方法で、証明は出来なかっただろう。それに私自身は、視覚的なイメージが好きな人間で、その当時、海馬の神経組織が生きている状態で切片を作って、共焦点レーザー顕微鏡下でニューロンの生まれる様子を、映画のように記録出来ないかと考えていた。自分が、あこがれの映画監督になるような仕事だ。このようなことを考えているときに、神経幹細胞がGFAP陽性であることを知って、私は、GFAP陽性細胞からニューロンが出来る過程を実際に顕微鏡下で観察することに挑戦することにした。海馬の切片を培養する方法は、以前、倉敷芸術総合大学産業技術学部の坂口卓也先生に習ってあったので、それを改良した。また、筑波大学人間総合科学の小野寺雅史先生、身近にいる順天堂大学神経内科の望月秀樹先生のお世話になって、緑色蛍光タンパク遺伝子（ウイルスベクター）を新しく生まれた細胞に入れる方法を学んだ。しかし、2000年に入って、年と共にいろいろな用事で、私自身は実験が出来る時間が減ってきた。とくに培養実験をやるにはある程度まとまった時間が必要である。そこで若い学生と一緒に研究がしたくなった。残念ながら順天堂大学では、解剖学教室に大学院生は来てくれないので、友人や後輩の伝手をたどって、学生を捜してみた。その結果、卒業研究で東京理科大から来てくれたのが難波隆志君だ。彼は大学院（早稲田大学）を含めると6年間、私の元で研究し、生きた海馬切片で、ニューロン新生を見るための、基礎的なデータ、方法など全てに渡って検討してくれた。中には、2時間おきに切片を顕微鏡で観察し30時間に渡って記録を取る（当然徹夜の仕事になる）、重労働もあったが、情熱を持って研究に望んでくれた（図4）10) 11, 12)。幸いなことに、研究中に、昭和大学医学部解剖学教室の塩田清二先生から、GFAP発現細胞が緑色に光る遺伝子改変マウスをいただき、最終的には、GFAP陽性細胞からニューロンに分化する決定的場面をとらえた。この論文は現在投稿中だである。

　大人の海馬で生まれるニューロンに関する論文は年々増加してきている。私が所属していた順天堂大学でも、神経内科、脳神経外科、精神科、生理学教室で大人の海馬のニューロン新生について研究している。さらに、日本の大学、世界の大学で現在莫大な数の研究が行われている。驚くべき状態だ。私自身は、人と競争をしてやる研究は大嫌いで、人が知らないことを、こっそり見ている方が好きだ。また、実際のところ、競争するような人手もお金もない。そんな訳で、最近は、大人の脳のニューロン新生でも、まだ世界の研究者が注目していない話題、具体的に言うと、大人の神経幹細胞の起源の問題に取り組んでいる。そして、そこに宝が隠されていると固く信じているのだ。

参考文献

1) 石龍徳:  成体海馬におけるニューロンの新生. 神経研究の進歩 46:221-236 (2002)

2) Seki T, Arai Y:  Highly polysialylated neural cell adhesion molecule (NCAM-H) is expressed by newly generated granule cells in the dentate gyrus of the adult rat. J Neurosci 13:2351-2358 (1993)

3) Seki T, Arai Y:  Temporal and spacial relationships between PSA-NCAM-expressing, newly generated granule cells, and radial glia-like cells in the adult dentate gyrus. J Comp Neurol 410:503-513 (1999)

4) Yamaguchi M, Saito H, Suzuki M, Mori K:  Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport 11:1991-1996 (2000)

5) Fukuda S, Kato F, Tozuka Y, Yamaguchi M, Miyamoto Y, Hisatsune T:  Two distinct subpopulations of nestin-positive cells in adult mouse dentate gyrus. J Neurosci 23:9357-9366 (2003)

6) Doetsch F, Caille I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A:  Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 97:703-716. (1999)

7) Kishi K:  Golgi studies on the development of granule cells of the rat olfactory bulb with reference to migration in the subependymal layer. J Comp Neurol 258:112-124 (1987)

8) Alvarez-Buylla A, Theelen M, Nottebohm F:  Proliferation "hot spots" in adult avian ventricular zone reveal radial cell division. Neuron 5:101-109 (1990)

9) Seri B, Garcia-Verdugo JM, McEwen BS, Alvarez-Buylla A:  Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci 21:7153-7160. (2001)

10) Seki T, Namba T, Mochizuki H, Onodera M:  Clustering, migration and neurite formation of neural precursor cells in the adult rat hippocampus. J Comp Neurol in press (2007)

11) Namba T, Mochizuki H, Onodera M, Namiki H, Seki T:  Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. J Neurosci Res 85:1704-1712 (2007)

12)   Namba T, Mochizuki H, Onodera M, Mizuno Y, Namiki H, Seki T:  The fate of neural progenitor cells expressing astrocytic and radial glial markers in the postnatal rat dentate gyrus. Eur J Neurosci 22:1928-1941 (2005)